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| 先生： |
為什么有的基因定位結(jié)果與預(yù)想的不一致？
對于一個特定的定位載體，只要熒光表達較好，BIFC，其定位結(jié)果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時候和預(yù)想的結(jié)果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達載體以及熒光蛋白融合方式等有關(guān)。
為什么有的普通定位結(jié)果出來后無法準(zhǔn)確判斷其定位位置？
細胞中的細胞器復(fù)雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區(qū)分。這時可以結(jié)合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復(fù)雜的過程，涉及到多個合成場所及轉(zhuǎn)運過程，自身表達情況可能比較復(fù)雜，因此不易判斷具體的表達位置。
為什么不先對一個基因做預(yù)測，在預(yù)測的結(jié)果上直接做共定位？
不同的預(yù)測網(wǎng)站有不同的計算方法，同一個基因在不同的預(yù)測網(wǎng)站也可能得出不同的定位結(jié)果。另外所有的結(jié)果都應(yīng)是基于實驗得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據(jù)普通定位的結(jié)果再決定做哪種細胞器的共定位。
為什么有的基因做原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時熒光蛋白不亮？
不同物種的細胞可能對基因表達有影響，當(dāng)在一種材料的原生質(zhì)體中觀察不到熒光時，可以考慮換一種受體材料。另外，如果是分泌蛋白，在原生質(zhì)體中無法觀察到熒光，此時可以考慮注射葉片來觀察熒光。
拍攝時為什么有明場通道？
（1）顯示細胞狀態(tài)，有活力的原生質(zhì)體細胞應(yīng)該是飽滿圓潤的，變形或破碎的細胞說明此時細胞不是適狀態(tài)或細胞已。
（2）顯示熒光確實是細胞內(nèi)蛋白表達的，而不是細胞碎片及雜質(zhì)產(chǎn)生的雜光。
構(gòu)建亞細胞定位載體時，GFP融合位置為什么有N端、C端之分？
若序列中存在信號肽，則構(gòu)建載體時需避開這一端來融合熒光蛋白。需注意不同的融合方式可能會得到不同的定位結(jié)果，例如融合在熒光蛋白N端的目標(biāo)蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結(jié)果；融合在熒光蛋白C端的目標(biāo)蛋白一般無法得到線粒體、質(zhì)體的定位結(jié)果。
為什么不同的受體材料有時得到的定位結(jié)果不一樣？
不同物種的細胞在翻譯表達基因時，其表達模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個載體在不同的受體材料中表達的位置可能不同，因此建議實驗時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進行表達。
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