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武漢貝科新肽科技有限公司
主營：原位雜交,亞細(xì)胞定位,蛋白互作,啟動子篩選
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以菌落原位雜交為例：對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行篩選時，可采用該方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到纖維素濾膜上
（1） 在含有選擇性的瓊脂平板上放一張纖維素濾膜。
（2） 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上，再轉(zhuǎn)移至含有選擇性但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種（或打點）。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒的菌落。
（3） 倒置平板，于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
（4） 用已裝防水黑色繪圖墨水的針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
（5） 用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4℃，直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
（6） 裂解細(xì)菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結(jié)合于纖維素濾膜。
DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比，DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強度較弱，動物組織原位雜交，因此在雜交后的洗滌中不應(yīng)使用甲醛。
探針特異性至關(guān)重要。如果已知細(xì)胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列，則可據(jù)此設(shè)計高度的互補探針。如果超過 5% 的堿基對不互補，那么探針只能與靶序列發(fā)生輕度雜交。這意味著，探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去，可能無法正確檢測。
原位雜交技術(shù)的技術(shù)流程
原位雜交技術(shù)的技術(shù)流程包括樣本處理、探針制備、雜交反應(yīng)和信號檢測等步驟。樣本處理包括組織或細(xì)胞的固定、包埋、切片和脫氧核糖核酸酶消化等步驟，目的是保持組織或細(xì)胞的原始結(jié)構(gòu)和核酸序列的完整性。探針制備包括標(biāo)記探針、純化和變性等步驟，目的是提高探針的特異性和敏感性。雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和洗脫等步驟，目的是使探針與目標(biāo)核酸序列形成雙鏈復(fù)合物。信號檢測包括顯色反應(yīng)、熒光染色和性同位素標(biāo)記等步驟，目的是可視化目標(biāo)核酸序列的分布。
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