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iTRAQ (isobarictags for relative and absolute quantitation,同位素標(biāo)記相對和絕1對定量)是由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同重同位素標(biāo)記的相對與絕1對定量技術(shù)。該技術(shù)使用8種(或4種)不同的同位素試劑來同時(shí)標(biāo)記和比較8種(或4種)不同的蛋白質(zhì)樣品。這些試劑由3個(gè)不同的化學(xué)標(biāo)簽組成:報(bào)告部分,肽反應(yīng)部分和平衡部分。報(bào)告部分為客戶可按需選擇標(biāo)記個(gè)數(shù),肽反應(yīng)基團(tuán)將iTRAQ標(biāo)簽與肽段的N-端基團(tuán)和每個(gè)賴氨酸側(cè)鏈相連,NTA檢測,可標(biāo)記所有酶解肽段,平衡部位可保證iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本的同一肽段具有相同的質(zhì)荷比,因此改變?nèi)我籭TRAQ試劑,不同同位素在標(biāo)記同一多肽后在一級質(zhì)譜檢測,分子量都完全相同。而在串聯(lián)質(zhì)譜中,同重元素標(biāo)記肽段平衡基團(tuán)在二級質(zhì)譜發(fā)生中性丟失。信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比的峰,因此,根據(jù)波峰的高度及面積,可以得到蛋白質(zhì)的定量信息。

外泌體研究開展的如火如荼。不論是 SCI 文章的發(fā)表還是各類基1金的申請,外泌體相關(guān)研究表現(xiàn)都非常亮眼。外泌體提取后,研究人員面臨的一個(gè)重要問題就是,我提取的是不是外泌體?如果是的話,質(zhì)量如何?

現(xiàn)階段,對外泌體進(jìn)行鑒定主要有三種主流的方法:電鏡、粒徑和 Western blot 分析靶標(biāo)物。之前我們已經(jīng)對外泌體電鏡進(jìn)行了總結(jié),今天我們來看看外泌體的粒徑分析。

外泌體粒徑分析原理

外泌體粒徑分析方法為納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle tracking Analysis, NT A),其原理是對每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追1蹤和分析,結(jié)合 Stockes-Einstein 方程式計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度。NT A技術(shù)已被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)可為外泌體表征手段之一。相較于其他表征方式,NT A技術(shù)的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快。

外泌體不僅含有蛋白質(zhì)抗原,還含有分泌細(xì)胞來源的mRNA或non-coding RNA(特別是miRNA),其功能引起廣泛關(guān)注。外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜可保護(hù)這些RNA,不被RNase分解,在血液、體液中穩(wěn)定存在。在外泌體及其分泌細(xì)胞中均可檢測出RNA,也存在僅能在其中之一檢測出RNA的情況,因此我們設(shè)想存在一種可以選擇性將特定的RNA吸收至外泌體的機(jī)制。

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