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武漢貝科新肽(圖)-原位雜交技術-原位雜交

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熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)是在20世紀80年代末在性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非性分子細胞遺傳技術,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交基礎上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術.

預雜交

1)每個管中置換成大約300ulHYB-溶液,原位雜交,60℃水浴5分鐘,避免振蕩。

2)用等體積的HYB+取代HYB-。

3)60℃水浴,原位雜交技術,預雜交4小時以上。

雜交

1)吸去預雜交的HYB+,加上100ul已加入探針的HYB+溶液(探針濃度約為1ng/ul)..

2)60℃ 溫浴過夜。

 注:雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等,溫度越低,探針結(jié)合越好,溫度越高,背景越小。

同一樣本可以多次做原位雜交實驗嗎?

一般情況下,植物組織原位雜交,如果操作沒有得到理想的結(jié)果,是可以將探針洗滌然后進行再次的雜交的。如果使用的是直標型探針,還可以使用不同探針對同一樣本進行反復雜交。針對不同的樣本,處理方法略有不同。

原位雜交實操中哪些因素比較重要?

重要的因素:溫度、光照、濕度和試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標DNA的雜交效率;光照影響著熒光染料的強度,所以探針要避光保存,其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬火劑封片且避光保存;各種試劑pH也要達到要求,這也直接關系到原位雜交的穩(wěn)定性。

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